體液樣本中細(xì)胞外囊泡的分析工具

本試劑盒是可用于細(xì)胞培養(yǎng)上清和體液樣本中細(xì)胞外囊泡的定性分析以及定量分析的酶聯(lián)免疫試劑。將能與細(xì)胞外囊泡表面的磷脂酰si氨酸（PS）特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)預(yù)包被到板上，細(xì)胞外囊泡與其反應(yīng)被固定后，以目的細(xì)胞外囊泡表面標(biāo)記蛋白的sheng物素標(biāo)記抗體作為檢測(cè)一抗，以試劑盒中的HRP標(biāo)記鏈霉親和素為二抗，可高靈敏度檢測(cè)表面具有靶標(biāo)記蛋白的細(xì)胞外囊泡。同時(shí)，可用不同物種的sheng物素標(biāo)記抗體作為檢測(cè)一抗。此外，二抗采用HRP標(biāo)記鏈霉親和素，與血液成分的非特異性結(jié)合低，可高靈敏度檢測(cè)血液樣本中的細(xì)胞外囊泡。

◆特點(diǎn)

●　高靈敏度和定量檢測(cè)

　  可以直接檢測(cè)樣本中的細(xì)胞外囊泡（無(wú)需分離）

　  可以從2.5 μL左右的血液樣本中檢測(cè)細(xì)胞外囊泡（節(jié)約樣本）

　  靈敏度是WB法的50~1000倍（檢測(cè)微量信號(hào)）

●　應(yīng)用廣泛

      可定性或定量檢測(cè)培養(yǎng)上清和血液樣本中的細(xì)胞外囊泡

      測(cè)定EV-depleted FBS中殘留的細(xì)胞外囊泡數(shù)量

      使用凝集素分析外泌體的糖鏈

●　通用的sheng物素標(biāo)記檢測(cè)方法

      一抗可靈活更換成不同動(dòng)物來(lái)源的抗體或凝集素等的sheng物素標(biāo)記一抗

●　操作簡(jiǎn)單以及再現(xiàn)性高

      優(yōu)化細(xì)胞外囊泡檢測(cè)用的試劑盒和試劑

◆檢測(cè)原理

　　FUJIFILM Wako試劑盒PS Capture™ Exosome ELISA Kit（Anti Mouse IgG POD）（Code No. 297-79201）（圖右）中，一抗使用小鼠抗體，二抗使用抗小鼠IgG抗體，但是本試劑盒（圖左），使用sheng物素標(biāo)記抗體作為一抗，二抗使用HRP標(biāo)記的鏈霉親和素。因此，可以不受限于抗體種類分析細(xì)胞外囊泡。

◆試劑盒組成

◆對(duì)應(yīng)樣本

◆數(shù)據(jù)

■　血液樣本以及培養(yǎng)上清液樣本的稀釋線性（Linearity）

用從COLO201細(xì)胞培養(yǎng)上清液中純化的細(xì)胞外囊泡制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線為基準(zhǔn)，檢測(cè)①人血清稀釋樣本，②人肝素血漿稀釋樣本，③人EDTA血漿稀釋樣本（各2個(gè)樣本，稀釋4次）以及④COLO201細(xì)胞培養(yǎng)上清液稀釋4次的樣本中的外泌體濃度（檢測(cè)CD63），評(píng)價(jià)各個(gè)樣本的稀釋線性。

結(jié)果表明，在CD63檢測(cè)中，血清和肝素血漿樣本在雙倍稀釋或更高稀釋度下可獲得良好的線性。EDTA血漿樣本在5倍以上稀釋度下可獲得良好的線性。

■　PS親和法和抗體法的比較（捕獲EVs的能力）

將預(yù)處理^※1的各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液分別添加至已固相化的抗CD抗體（CD9, CD63, CD81）或Tim4微孔板的各個(gè)孔中進(jìn)行反應(yīng)。然后，用各個(gè)sheng物素標(biāo)記抗CD抗體（CD9, CD63, CD81）檢測(cè)結(jié)合的外泌體。

※1 預(yù)處理?xiàng)l件: 10,000×g, 30分

PS親和法與抗體法相比，更高效率地捕抓到了各種細(xì)胞株來(lái)源的外泌體

■　測(cè)定市面上“無(wú)外泌體血清"中殘留的外泌體數(shù)量

用sheng物素標(biāo)記抗CD9抗體^※4檢測(cè)未處理的FBS，市場(chǎng)上售賣的“無(wú)外泌體血清"（ EV-depleted FBS）以及超離處理的FBS（UC-treated FBS）^※3 中殘存的外泌體。

※3 超離條件：160,000×g, 16 h

※4 用Biotin Labeling Kit-SH（產(chǎn)品編號(hào)：348-90941）標(biāo)記抗CD9抗體（產(chǎn)品編號(hào)：014-27763）。

Capture: Tim4 / Detection：sheng物素標(biāo)記抗CD9抗體

使用PS親和法的ELISA系統(tǒng)，可以簡(jiǎn)單便利地檢測(cè)到外泌體殘留量。

■　應(yīng)用于糖鏈分析：rBC2LCN凝集素和Tim4的雙抗夾心ELISA

用sheng物素標(biāo)記抗CD63抗體（產(chǎn)品編號(hào)：019-27713）和sheng物素標(biāo)記rBC2LCN凝集素^※6檢測(cè)預(yù)處理完成^※5的5倍稀釋iPS細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的外泌體。

※5 預(yù)處理?xiàng)l件: 10,000 × g, 30 min

※6 用 EZ-Link™ Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin（ThermoFisher公司）標(biāo)記rBC2LCN（產(chǎn)品編號(hào)：029-18061）。

捕獲用抗體: Tim4 / 檢測(cè)用抗體: 各sheng物素標(biāo)記體

＜參考文獻(xiàn)＞　S. Saito, et al., Sci. Rep., 8, 3997 (2018)

通過(guò)與各種凝集素相組合，可應(yīng)用于外泌體表面上的糖鏈分析。

■　檢測(cè)人正常血液樣本中外泌體標(biāo)記物的相對(duì)濃度

準(zhǔn)備人血清（10個(gè)樣本），EDTA血漿（9個(gè)樣本）和肝素血漿（9個(gè)樣本）作為正常血液樣本，檢測(cè)外泌體標(biāo)記物CD63和CD9，以及被認(rèn)為是癌細(xì)胞外泌體特異性標(biāo)記物的EpCAM。

結(jié)果顯示，在各個(gè)血液樣本中均檢測(cè)出了外泌體標(biāo)記物CD63和CD9，但只有在癌細(xì)胞外泌體中才檢測(cè)出極微量的表面抗原EpCAM。

■　COLO201來(lái)源純化外泌體的添加回收測(cè)試

準(zhǔn)備混合血清，EDTA血漿，肝素血漿的2倍稀釋液，并添加從COLO 201細(xì)胞培養(yǎng)上清中提取的3種濃度的COLO201來(lái)源外泌體，以EpCAM檢測(cè)來(lái)確認(rèn)回收率。

在EpCAM檢測(cè)中，添加回收率在100％±10％的范圍內(nèi)，顯示出良好的回收性能^※。

※ 考慮到【血液檢體的稀釋線性】，EDTA血漿樣本建議稀釋5倍以上進(jìn)行檢測(cè)。

◆抗外泌體標(biāo)記抗體系列

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PS Capture™ 外泌體ELISA試劑盒（抗小鼠IgG POD）